文章题目：Glycopeptide database search and de novo sequencing with PEAKS GlycanFinder enable highly sensitive glycoproteomics

发表期刊：Nature Communications (2023.07)

影响因子：16.6

通讯单位：Bioinformatics Solutions Inc., University of Waterloo

        蛋白糖基化是最普遍和最复杂的翻译后修饰(PTMs)之一，全面的糖基化分析对于诊断测试和潜在治疗的发展至关重要。糖蛋白组学的目的是在全系统水平上提供生物样品中糖基化的详细表征，其中，液相色谱串联质谱(LC-MS /MS)的最新进展使完整糖肽的位点特异性分析成为可能。然而，从串联质谱中准确鉴定完整的糖肽必须解决多肽可能存在多个糖基化位点和具有相同聚糖组成或质量的多个结构的异质性问题。

        在本篇文章中，作者提出了GlycanFinder糖蛋白组学软件包，包括数据库搜索和从头测序解决方案，采用观察谱图中的肽或聚糖离子用于鉴定完整的N-连接和O-连接糖肽。该方法与单独使用一种鉴别离子相比，减少了丢失肽或聚糖片段离子的信号的可能性。除此之外，文章对数据库搜索无法识别的谱图进行N-糖链从头测序，从质谱中重建聚糖树型结构。

图1：(a) N-糖基化肽段匹配谱图; (b)糖肽数据库搜索和从头测序的工作流程; (c) N-糖链从头测序

        图1b说明了GlycanFinder完整糖肽分析的工作流程。GlycanFinder同时应用基于肽的和基于聚糖的搜索，提高其灵敏度。在基于肽的搜索中，glycopeptide spectrum在蛋白质数据库中快速搜索以识别候选肽，然后根据前体质量和各自的候选肽从聚糖数据库中选择候选聚糖。对于那些已确定多肽但未从glycan数据库中找到匹配的聚糖的光谱，则执行从头测序以鉴定潜在的新N-糖链(图1c)。如果在基于肽的搜索之后光谱仍然未被识别，则进行基于聚糖的搜索，首先搜索候选聚糖，然后推断候选肽。

图2：糖肽类数据库性能评价

        评估蛋白质组学搜索引擎的最重要是测试假阳性发现率（FDR）的准确度，对于本文中的策略来说，糖聚糖和肽的FDR都需要考虑在内。作者对裂变酵母糖蛋白组样本进行N-连接糖肽分析，并将GlycanFinder的结果与其他三个工具(pGlyco3、MetaMorpheus、MSFragger)进行比较。

        如图2a所示，GlycanFinder已鉴定的糖肽谱匹配数比pGlyco3多13.6%，比MSFragger少17.0%。MetaMorpheus鉴定量最多但其多糖FDR高。图2b中的维恩图显示，GlycanFinder独特的糖肽鉴定量比pGlyco3高2.7%，比msfragger低17.4%。放宽评分阈值后，FDR与MSFragger相当。此外，值得注意的是MSFragger是基于聚糖组成的，而GlycanFinder和pGlyco3报告的是聚糖结构，提供了更全面的信息。

图3：StrucGP和GlycanFinder的糖链测序精度比较

        GlycanFinder和strucgp在5个小鼠组织上的检测准确率汇总如图3所示，GlycanFinder在结构、片段离子和组成三个层面上的平均准确率分别为32%、83%和89%，平均结构准确性大大高于StrucGP。这些结果证明了GlycanFinder深度学习模型在学习和预测新聚糖树结构方面的优势。

图4：四种免疫球蛋白G亚类IgG1-4的N-糖基化分析

        图4进一步显示了四个IgG1-4亚类和两个生物重复上N-糖链的定量结果。IgG1和IgG2表现出相似的N-糖链定量谱，而IgG3和IgG4定量谱与IgG1和IgG2有很大不同。作者从两种不同的工具和三个搜索引擎中观察到一致的量化结果。将IgG糖基化分析和无标记定量结合在一起，可以对多个样品进行比较分析，以确定与糖基化失调相关的免疫疾病的诊断测试和潜在治疗的生物标志物。

        研究结果表明，GlycanFinder在FDR控制和鉴定数量方面取得了与其他领先的糖蛋白组学软件相当的性能。此外，GlycanFinder还能够识别现有数据库中没有发现的糖肽。抗体N-糖基化谱的质谱实验，可以区分四种免疫球蛋白G亚类的异构体肽和聚糖，这是以往研究中一个具有挑战性的问题。

原文链接：10.1038/s41467-023-39699-5

作者：汪浩

审核：李全才

编辑：邵萌

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