文章题目：A Fixable Fluorescence-Quenched Substrate for Quantitation of Lysosomal Glucocerebrosidase Activity in Both Live and Fixed Cells

发表期刊：Journal of the American Chemical Society

影响因子：15.0

通讯单位：Department of Chemistry, Simon Fraser University

图1：可固定的荧光淬灭底物设计方案。A) GCase催化水解荧光淬灭底物以及随后使用多聚甲醛（PFA）将荧光产物与细胞内蛋白质交联的示意图。B) 利用细胞内蛋白的免疫细胞化学（ICC）染色对GCase活性进行多重测量。C) LysoFQ-GBA、单赖氨酸和三赖氨酸 LysoFix-GBA 类似物的结构

        荧光底物是一种新兴工具，可用于研究在小分子调节剂和不同细胞调控因子存在的情况下原生细胞环境中的酶促过程，并且可以更深入地了解与疾病相关的酶活和调控过程，以及这些过程影响疾病病理的具体机制。然而，大多数的荧光底物在经过酶促代谢后，会迅速扩散出细胞，这种扩散会严重影响荧光底物对目标酶空间和活性信息的检测效果，并且在活细胞内发挥作用的荧光底物通常与细胞固定不相容，因此无法与免疫细胞化学等基本细胞生物学方法同时应用。

        在这篇文章中，作者开发了一种可固定的荧光淬灭底物LysoFix-GBA，它可以有效检测活细胞和多聚甲醛（PFA）固定细胞内溶酶体GCase（溶酶体葡萄糖脑苷脂酶）的活性和空间信息。该荧光底物将有助于研究GCase活性在帕金森病中的作用，并促进创造出针对GCase通路的新治疗方法。

图2：LysoFix-GBA的合成路线

        图1和2介绍了LysoFix-GBA的设计合成路线。LysoFix-GBA是针对LysoFQ-GBA通过理性改造获得的（图1C），作者在葡萄糖 O-6 位置延伸的连接臂是添加了短的赖氨酸肽段，该肽段可有效靶向溶酶体，并且在PFA的固定过程中将荧光基团与GCase交联，从而保留空间信息（图1A和B）。除此之外，作者还用红移更强的荧光团TAMRA取代了LysoFQ-GBA中使用的BODIPY-FL荧光团，以减少细胞自发荧光来提高探针的灵敏度。

        获得了LysoFix-GBA，作者通过体外测量以确定其是否为GCase的适合底物。结果显示，LysoFix-GBA被重组GCase裂解的二阶速率常数（k_cat/K_M=880 M^-1 min^-1）（图3A）竟然优于LysoFQ-GBA（k_cat/K_M=65 M^-1 min^-1）。除此之外，LysoFQ-GBA被GCase裂解后，其荧光猝灭效率＞99.6%（图3B）。这两点都证明了LysoFQ-GBA在监测细胞内溶酶体GCase活性方面的潜在价值。

图3：在体外检测 GCase 活性分析中LysoFix-GBA的定量性质。A) LysoFix-GBA与重组GCase（100 nM）的Michaelis-Menten动力学。B)比较LysoFix-GBA 和TAMRA的标准曲线，以确定完整底物的淬灭效率。C) LysoFix-GBA在活SK-N-SH 细胞中的时间和剂量依赖性。D) LysoFix-GBA在固定的SK-N-SH细胞中的时间和剂量依赖性反应。E)固定细胞和活细胞中GCase活性的荧光信号强度进行线性回归分析。

            获得体外实验结果后，作者开始评估LysoFix-GBA定量测定活细胞和固定细胞内溶酶体 GCase活性的能力。结果显示，LysoFix-GBA在活和固定后的SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中转化产生的荧光信号均显示出线性区域（图3C和D），并且PFA固定前后荧光强度呈明显的线性相关（R²=0.99，图3E），这些数据表明，当使用的浓度和时间在这些线性响应区域内时，LysoFix-GBA可用于对活细胞和固定细胞进行定量测量。

图4：利用LysoFix-GBA评估基因敲除对溶酶体 GCase 活性的影响。B）LysoFix-GBA监测 WT（绿色）、GBA KO（红色）和 SCARB2 KO（橙色）SK-N-SH 细胞中 GCase活性的。C) 固定细胞系中LysoFix-GBA信号强度的代表性荧光显微镜图像。D）和E）野生型和GBA KO细胞中GCase 活性增强。

        在证明了LysoFix-GBA可用于测量GCase活性之后，作者继续评估是否可以使用LysoFix-GBA检测直接或间接的基因干扰。结果显示，LysoFix-GBA能够有效检测直接敲除的GBA KO细胞和间接敲除（缺少LIMP-2，减少GCase转运）的SCARB2 KO细胞中GCase活性（图4B和C）。添加外源重组GCase到GBA1 KO细胞中，通过LysoFix-GBA检测发现溶酶体GCase活性在 24 小时内出现了短暂的增加（图4D, E），这证明LysoFix-GBA不但可以检测GCase降低，也可以检测活性提高。进一步研究发现，LysoFix-GBA也可用于检测不同的细胞系和细胞类型的GCase活性(图5)。这些结果均证明了LysoFix-GBA在检测活细胞GCase活性的广泛适用性。

图5：使用LysoFix-GBA在PD和GD患者诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经祖细胞（NPC）中测量的溶酶体GCase活性水平反映了他们的GBA等位基因状态。

        目前无法通过免疫细胞化学法（ICC）检测细胞蛋白质分布的同时测量GCase的活性，由于LysoFix-GBA的酶促产物可以有效地固定在细胞中，作者推断应该可以使用LysoFix-GBA和ICC将活性测量与蛋白质分布观察结合起来。结果显示， GCase活性与高尔基体标记GM130或线粒体标记TOM20的共定位水平很低。GCase活性与早期内体标记物EEA1或再循环内体标记物RAB11的共定位非常少（图5A和B），不过，GCase 活性与晚期内体标记物Rab7有中度共定位（图5B和C）。最后，作者观察到了与溶酶体标记物LAMP1和LAMP2的显著共定位（图5B和C），这与成熟GCase在溶酶体内是一致的。这些结果说明，LysoFix-GBA和ICC共同使用，可以获得GCase在不同亚细胞空间的活性数据。

图6：通过免疫细胞化学（ICC）成像的LysoFix-GBA信号与各种亚细胞蛋白标记物的共定位。A) 共聚焦图像显示，在固定的SK-N-SH细胞内，LAMP2（绿色）和GCase活性（红色）高度共聚焦。B) A549细胞中LysoFix-GBA信号与不同亚细胞标记物的Pearson相关系数（PCC）。C) 具有代表性的荧光显微镜图像显示 LysoFix-GBA与亚细胞器和区室不同程度的共定位。

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202309306

作者：汪浩

审核：李全才

编辑：邵萌

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