文章题目：Organ/Cell-Selective Intracellular Delivery of Biologics via N-Acetylated Galactosamine-Functionalized Polydisulfide Conjugates

发表期刊：JACS

影响因子：15.0（2022）

通讯单位：北京大学 化学与分子工程学院

        今天分享的是北京大学化学与分子工程学院吕华教授课题组2月1日在《JACS》杂志上在线发表的关于GalNAc化聚二硫醚缀合物实现器官/细胞胞内生物制剂递送的研究。

图1. GalNAc化聚二硫醚缀合物靶向递送平台

        目前多肽类和核酸类生物制剂药物研究日益深入，但该类药物在机体给药的过程中面临各种生物障碍，需要具有靶向性的特异递送系统来辅助给药。使用与肝细胞特异性去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）结合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)三价缀合物将寡核苷酸（ASO）靶向递送至肝细胞已成为治疗性寡核苷酸领域的突破性方法，并已有大量研究进入临床试验阶段，Givosira也因该技术实现突破，获批用于治疗急性肝卟啉症^[1]。

图2. 三价GalNAc与肝细胞表面ASGPR结合介导ASO内化过程

        聚二硫醚聚合物可以通过硫醇-二硫化物交换反应实现细胞膜穿透，提高聚合物与细胞表面蛋白的结合能力，避免所需递送药物的过早释放，同时提高细胞内化能力。因此，研究人员合成了带有不同疏水linker的GalNAc衍生化硫辛酸单体（如图3A所示），通过聚集诱导聚合效应提高该单体在反应溶液中的局部浓度，加快开环聚合^[2]，使用带有半胱氨酸的增强型绿色荧光蛋白突变体（EGFP-SH）作为模型引发剂进行聚合反应，通过SDS-PAGE凝胶电泳分析发现几乎无EGFP单体剩余，且产物条带分布狭窄，进一步通过SEC液相分析发现产物分散系数接近1，证明该聚合反应的高效性和带巯基蛋白接枝的优异偶联性。

图3. A：带有不同疏水linker的GalNAc衍生硫辛酸单体；B：EGFP-SH引发GalNAc衍生硫辛酸开环聚合；C：LPA-C2GalNAc单体的核磁氢谱表征；D：不同EGFP-p(R-GalNAc) 缀合物的SDS-PAGE表征；E：EGFP-p(C2-GalNAc)缀合物的SEC液相表征。

        在制备得到EGFP接枝的GalNAc衍生聚二硫醚缀合物后，研究人员通过流式细胞术研究细胞对缀合物的摄取情况，选用了高表达ASGPR的HepG2细胞和低表达ASGPR的Hela细胞，并设置了市售FAM标记抗ASGPR抗体作为阳性对照和GlcNAc衍生聚二硫醚缀合物的对照。结果显示，EGFP接枝的GalNAc衍生聚二硫醚缀合物EGFP-p(C2-GalNAc)可被HepG2细胞高效摄取，可达到与抗体相同的水平，而不带有GalNAc修饰的缀合物以及GlcNAc修饰的缀合物均不被细胞摄取（如图4A所示）。进一步通过加入抑制剂竞争抑制细胞内化缀合物，发现GalNAc单体和聚合物p(C2-GalNAc)能明显抑制细胞对缀合物的内吞摄取，且聚合物的抑制能力比GalNAc单体高100倍以上，这充分显示了聚合物的多价效应优势（如图4B所示）。

图4. A：流式细胞术评价细胞内化缀合物情况；B：不同抑制剂对HepG2细胞内化EGFP-p(C2-GalNAc)缀合物的抑制情况。

        由于聚二硫醚缀合物可以通过硫醇-二硫化物交换反应实现细胞膜穿透，因此研究人员使用不同的硫醇封闭剂来封闭细胞表面的硫醇基团，结果发现均能有效抑制缀合物的内化。通过激光共聚焦显微镜观察发现，EGFP-p(C2-GalNAc)缀合物能有效实现细胞胞内递送，且不与溶酶体共定位（如图5D所示）。

图5. C：硫醇封闭剂可有效抑制缀合物内化；D：激光共聚焦显微镜观察缀合物的胞内递送情况。

        根据前面的实验过程，研究人员总结出以下EGFP-p(C2-GalNAc)缀合物被细胞摄取内化的机制：HepG2表面过表达ASGPR，与缀合物的GalNAc通过多价效应高效特异性结合，并启动ASGPR介导的内吞过程，同时细胞表面的硫醇基团与缀合物进行硫醇-二硫键交换实现细胞内化，二者共同作用实现胞内高效递送（如图6所示），该过程可以在细胞表面硫醇被封闭后仍有缀合物内化被观察到而得到验证。在缀合物进入胞内后，肝细胞内高浓度的谷胱甘肽（GSH）对缀合物的二硫键进行还原，实现缀合物接枝蛋白的释放。

图6. EGFP-p(C2-GalNAc)缀合物被细胞摄取内化途径的机制图

        进一步验证发现，该缀合物被细胞摄取内化程度具有缀合物浓度、孵育时间和GalNAc接枝度依赖性，均呈正相关。但在聚合物的聚合度上有些有趣的发现，因ASGPR与GalNAc结合是以三价的形式，虽然多价效应会提高结合程度，但过高的聚合度反而会降低结合信号，该现象也可能与高聚合度的聚二硫醚增加了GalNAc-ASGPR结合位点与硫醇-二硫键交换反应位点之间间距有关。

图7. EGFP-p(C2-GalNAc)缀合物被细胞摄取内化程度与缀合物浓度（A）、孵育时间（B）和GalNAc接枝度（C）呈正相关；D：不同聚合度的缀合物被细胞摄取内化程度。

        在使用寡核苷酸（ASO）引发聚合反应的时候，研究人员发现由于ASO的高负电荷会导致反应失败，加入高活性的阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)后可得到聚合产物（如图8A和B所示）。研究人员选用肝脏代谢紊乱的常见治疗靶点—前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶-kexin 9 型（PCSK9）作为靶点，使用硫醇衍生的抗PCSK9的ASO，运用改技术平台，成功降低了HepG2细胞中的PCSK9蛋白水平（如图8D和E所示）。

图8. A：ASO接枝缀合物的合成；B：ASP和缀合物的琼脂糖凝胶电泳分析；C：流式细胞术验证Cy3衍生的ASO和缀合物细胞内化情况；D、E：经缀合物治疗后HepG2细胞PCSK9蛋白水平变化。

        最后，研究人员在动物水平上评价了缀合物的肝靶向递送能力。使用带有游离半胱氨酸的干扰素突变体（IFN）制备缀合物IFN-p(EG2GalNAc)，使用IFN和GlcNAc衍生的缀合物IFN-p(GlcNAc)作为阴性对照，进行小鼠实验后通过活体成像发现，缀合物IFN-p(EG2GalNAc)在约2.5 h时在小鼠肝脏中达到最大信号，在4 h后缓慢下降，24 h后几乎观察不到荧光信号（如图9A所示），但对小鼠进行解剖后发现，肝脏较其他器官荧光信号更加明显，证明了该缀合物技术平台将生物制剂靶向输送至肝脏的潜力。

图9. A：不同时间点的小鼠活体成像；B：24小时后解剖的小鼠器官荧光信号

        参考文献 

        (1) O’Sullivan, J.; Muñoz-Muñoz, J.; Turnbull, G.; Sim, N.; Penny, S.; Moschos, S. Beyond GalNAc! Drug Delivery Systems Comprising Complex Oligosaccharides for Targeted Use of Nucleic Acid Therapeutics. RSC Adv. 2022, 12 (32),  20432–20446.  https://doi.org/10.1039/D2RA01999J.

        (2) Lu, J.; Xu, Z.; Fu, H.; Lin, Y.; Wang, H.; Lu, H. Room-Temperature Grafting from Synthesis of Protein–Polydisulfide Conjugates via Aggregation-Induced Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 2022, 144 (34),  15709–15717.  https://doi.org/10.1021/jacs.2c05997.

        原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c11914

作者：王礼浩

审核：李全才，吕友晶

编辑：邵萌

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