文章题目：Next-Generation Metabolic Glycosylation Reporters Enable Detection of Protein O−GlcNAcylation in Living Cells without S-Glyco Modification.

发表期刊：Angew. Chem. Int. Ed.

影响因子：16.6（2022）

通讯单位：德国康斯坦茨大学化学系

        今天分享的是德国康斯坦茨大学化学系ValentinWittmann课题组3月19日在《Angew. Chem. Int. Ed.》杂志上报道的新一代无副反应的活细胞内蛋白O-GlcNAc糖基化代谢标记技术。

图1. 新一代活细胞内蛋白O-GlcNAc糖基化代谢标记技术

        代谢糖工程是一种用于检测细胞内蛋白/聚糖糖基化的技术，通过使用化学合成的带有报告基团（图2中X）的单糖衍生物与细胞共孵育，被细胞摄取后利用，在酶促反应催化下转移至蛋白或聚糖，随后通过生物正交反应与功能探针（如荧光基团等）高效连接，从而可用于对活细胞中目标糖蛋白或聚糖实现示踪或组学分析等。在众多糖基化中，蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰与许多生理病理过程相关，如心血管疾病、癌症和神经系统疾病等，目前使用代谢糖工程技术研究蛋白的O-GlcNAc化已有二十年的历史，此前使用的都是全乙酰化保护的GlcNAc衍生物（下图中化合物A），以增加其胞内渗透性，但在2017年,北京大学化学与分子工程学院陈兴教授课题组与王初教授课题组偶然间发现这类全乙酰化的单糖衍生物在细胞内会发生蛋白半胱氨酸位点S-糖基化的副反应（如图2所示），导致假阳性信号的出现^[1]。避免该副反应的方法是使用非保护的单糖衍生物，但该类化合物细胞渗透性差，利用度不高，因此亟需开发一种即能避免S-糖基化副反应，又能对活细胞内蛋白O-GlcNAc糖基化进行高效代谢标记的技术。

图2. 全乙酰化GlcNAc和GlcNAc-1-磷酸衍生物糖代谢标记过程

        已有研究证实，使用带保护的异头位磷酸酯基团的GlcNAc衍生物（图2中J）可以高效的进入细胞，并直接被UDP-GlcNAc 焦磷酸化酶（AGX）识别并转化为UDP-GlcNAc衍生物（图2中E），但细胞内天然AGX对他们使用的N-乙酰上修饰的报告基团耐受性差，需要对AGX进行突变^[2]，而降冰片烯修饰的非天然单糖在代谢糖工程中已有报道^[3]，或许正确连接的降冰片烯修饰的GlcNAc-1-磷酸酯衍生物可兼容天然AGX，基于此，研究者们设想将降冰片烯作为报告基团X引入GlcNAc-1-磷酸糖探针中，利用降冰片烯基团后续可与四嗪基团发生逆电子需求狄尔斯-阿尔德 (IEDDA) 反应的特点，同时解决细胞渗透率低和S-糖基化副反应的问题，开发新一代活细胞中蛋白O-GlcNAc的代谢糖标记技术。

图3. 本文中合成的用于O-GlcNAc代谢标记的非天然糖及其在糖代谢标记中的表现

        研究者们在合成得到降冰片烯修饰的全乙酰化GlcNAc衍生物Ac₄GlcNNorboc后，通过磷（V）化学试剂引入带保护的磷酸酯基团，制备了两种全保护的GlcNAc-1-磷酸酯衍生物Ac₃GlcNNorboc-1-P(SATE)₂和A_c3GlcNNorboc-1-P(SPTE)₂，同时在该研究团队之前的调研中发现芳氧基氨基磷酸酯型磷酸酯保护的核苷类化合物在细胞内裂解保护基时释放出的产物毒性更小，因此继续制备了芳氧基氨基磷酸酯型磷酸酯化的GlcNAc衍生物Ac₃GlcNNorboc-1-P(OPh)N-Ala-OiPr，期待其在活细胞糖代谢标记体系中具有更好的生物相容性。

        在使用上述四种糖探针进行糖代谢标记时，研究者首先对Hela S3细胞裂解液进行非特异性标记，并用四嗪基团修饰的Cy3染料进行显色，结果发现异头位未被磷酸酯修饰的糖探针Ac₄GlcNNorboc会发生非特异性标记（图3中A），而磷酸酯化的三种探针则不会发生副反应。在细胞毒性检测中，四种探针在100μM高浓度下生物相容性良好（图3中B）。研究者随后在HeLa S3细胞（图3中C）和HEK 293T细胞（图3中D）进行了糖代谢标记，结果显示，Ac₄GlcNNorboc由于出现了标记信号，但由于S-糖基化副反应的存在，有假阳性信号干扰；Ac₃GlcNNorboc-1-P(SATE)₂呈现良好的特异性标记信号，而其余两种糖探针呈现很弱的标记信号

图4. 新一代降冰片烯糖探针实现蛋白质特异性糖基化的标记

        随后，研究者对只具有O-GlcNAc修饰的肿瘤抑制因子p53蛋白（核蛋白，有一个O-GlcNAc修饰位点）和叉头框蛋白O1（Foxo1，细胞质蛋白，有6个O-GlcNAc修饰）进行代谢糖标记，在HEK 293T细胞中转染p53-eGFP、Foxo1-eGFP和eGFP表达载体以表达相应蛋白，代谢糖标记后进行Cy3染色，结果显示Ac₃GlcNNorboc-1-P(SATE)₂显示最强的标记信号（Ac₄GlcNNorboc由于非特异性糖标记也有强荧光信号），其余两种也有弱标记信号，且这种标记策略不会标记非O-GlcNAc糖基化的eGFP蛋白（图4中A）。之后他们又对驱动蛋白家族成员18A（Kif18A）蛋白进行O-GlcNAc糖基化可视化标记，在HeLa细胞中诱导表达eGFP-Kif18A和 eGFP，代谢糖标记后进行Cy3染色，得到了与之前相同的结果（图4中B）。

图5. Ac₃GlcNNorboc-1-P(SATE)₂与O−GlcNAc化循环相关酶的互作

        接下来为了验证降冰片烯修饰的GlcNAc衍生物的掺入是否依赖于糖基转移酶OGT，以及降冰片烯修饰的GlcNAc衍生物是否可以被糖苷酶OGA裂解，在HEK 293T细胞中过表达了OGT，与未转染的细胞相比，荧光信号的增加证实了OGT的参与了代谢糖标记过程，且该过程可被OGT抑制剂Ac₄-5S-GlcNAc抑制（图5中A和B）。使用pNP衍生的GlcNNorboc和GlcNAc进行OGA酶解实验，通过检测水解产物对硝基苯酚在405 nm处的吸光度信号，可发现降冰片烯修饰的GlcNNorboc不会被OGA水解（图5中E），从而可在糖代谢标记过程中保持稳定。

图6. Ac₃GlcNNorboc-1-P(SATE)₂实现活细胞中蛋白O-GlcNAc糖基化成像

        最后，研究者为了探究是否可使用Ac₃GlcNNorboc-1-P(SATE)₂探针实现两个荧光基团之间的荧光共振能量转移（FRET），从而实现活细胞中各种蛋白质特异性糖基化的成像，他们在HEK 293T细胞中诱导表达了目标蛋白（POI）与eGFP的融合蛋白，并通过糖代谢标记掺入O−GlcNNorboc残基，之后加入四嗪-四甲基罗丹明 (Tz-TAMRA) 缀合物，在发生IEDDA反应之后eGFP与TAMRA之间可发生FRET，从而实现蛋白糖基化可视化成像（图6中A所示过程）。研究者在HEK 293T细胞中分别诱导表达了p53-eGFP融合蛋白和Foxo1-eGFP融合蛋白，使用Ac₃GlcNNorboc-1-P(SATE)₂进行活细胞代谢糖标记，之后孵育Tz-TAMRA，进行成像后发现p53-eGFP融合蛋白的成像只存在与细胞核内而Foxo1-eGFP融合蛋白的成像只存在与细胞质中（图6中B），且对于100 μM糖探针处理条件下的FRET率可达到22%和29%（图6中C），证实Ac₃GlcNNorboc-1-P(SATE)₂是可用于活细胞内细胞内蛋白质O−GlcNAc修饰特异性成像的有效工具！

        综上所述，在本文中，作者团队介绍了一种新型的活细胞蛋白质O-GlcNAc化特异糖代谢标记的糖探针，该探针同时具有N-乙酰-降冰片烯修饰和异头位全保护的磷酸酯基团修饰，在避免了S-糖基化副反应的同时，具有良好细胞渗透性和O-GlcNAc化蛋白糖代谢标记的高效性。

        原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ange.202320247

        参考文献

        [1] Qin, W.; Qin, K.; Fan, X.; Peng, L.; Hong, W.; Zhu, Y.; Lv, P.; Du, Y.; Huang, R.; Han, M.; Cheng, B.; Liu, Y.; Zhou, W.; Wang, C.; Chen, X. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57 (7), 1817–1820. https://doi.org/10.1002/anie.201711710.

        [2]  Yu, S.-H.; Boyce, M.; Wands, A. M.; Bond, M. R.; Bertozzi, C. R.; Kohler, J. J. Metabolic Labeling Enables Selective Photocrosslinking of O-GlcNAc-Modified Proteins to Their Binding Partners. Proc. Natl. Acad. Sci. 2012, 109(13), 4834–4839. https://doi.org/10.1073/pnas.1114356109.

        [3] Späte, A.-K.; Dold, J. E. G. A.; Batroff, E.; Schart, V. F.; Wieland, D. E.; Baudendistel, O. R.; Wittmann, V. Exploring the Potential of Norbornene-Modified Mannosamine Derivatives for Metabolic Glycoengineering. Chembiochem2016, 17 (14), 1374–1383. https://doi.org/10.1002/cbic.201600197.

作者：王礼浩

审核：李全才、吕友晶

编辑：邵萌

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