文章题目：Epi-Cyclophellitol Cyclosulfate, a Mechanism-Based Endoplasmic Reticulum α-Glucosidase II Inhibitor, Blocks Replication of SARS-CoV-2 and Other Coronaviruses

发表期刊：ACS Central Science（2024.07）

影响因子：12.7

通讯单位：莱顿大学传染病中心

        冠状病毒作为是一种非细胞生命形态，它的复制、转录、翻译以及翻译后的修饰都依赖于宿主细胞。作为翻译后修饰中重要组成部分，糖基化修饰，特别是N-糖链修饰对冠状病毒包膜蛋白质的正常折叠、稳定性和生物功能的发挥均至关重要。在内质网（ER）中，α-葡萄糖苷酶I和 II（α-Glu I和α-Glu II）负责酶解新生N-糖链的末端葡萄糖，由此产生的单葡萄糖基化的N-糖链，随后携带该N糖链的蛋白会被ER伴侣蛋白和钙网蛋白(CNX–CRT cycle)识别，从而防止蛋白质聚集并实现多肽折叠(Figure 1)。研究表明，抑制ER α-Glu I和α-Glu II会干扰新生蛋白质在CNX–CRT cycle中的正常加工，导致其折叠不当和蛋白降解。这对病毒的N-糖链修饰的蛋白同样适用，因此ER α-Glu I和α-Glu II抑制剂一直被认为是开发抗病毒药物的可行策略。

Figure 1. Schematic of N-glycan processing of newly synthesized proteins in the ER lumen. Folding of nascent proteins in the ER is promoted by the calnexin–calreticulin cycle (CNX–CRT cycle), which relies on glycan trimming by ER α-Glu II.

        在这篇文章中，作者筛选了含有环糖醇（cyclitol）和亚氨基糖（iminosugars）这两类化合物库（Figure 2），研究了它们对 ER α-Glu II 的抑制作用以及对SARS-CoV-2的抗病毒活性。发现1,6-epi-cyclophellitol cyclosulfate (11)能最有效地降低α-Glu II的酶活性，对SARS-CoV-2的抗病毒效果最优。

Figure 2. Focused library of 28 iminosugars and cyclitol subjects of the here-presented studies.

        首先，作者通过体外酶活测定对28种拟糖分子进行了内质网α-葡萄糖苷酶 II（ER α-Glu II，GANAB）抑制作用筛选。结果显示，化合物11是最有效的ER α-Glu II 抑制剂（IC50=0.03 μM），化合物2是最有效的竞争性抑制剂（IC50=0.12 μM）。继续通过细胞病理效应（CPE）降低试验中分析了所有化合物对SARS-CoV-2的抗病毒活性，其中，化合物11在酶抑制和SARS-CoV-2 CPE试验中都是最有效的化合物（Figure 3A，C-E）。

Figure 3. ER α-Glu II inhibitory potency correlates with reduction of SARS-CoV-2 mediated cytopathic effect in cell culture.

        为了进一步证实CPE降低试验的结果，作者在病毒载量减少试验中评估了最有效的11对受感染的H1299/ACE2肺上皮细胞的影响。可以发现，化合物11的处理显著降低了感染细胞中的病毒量（Figure 4A），但是不能降低病毒核酸量（Figure 4B），这意味着化合物11可能通过抑制病毒蛋白的成熟，降低了病毒对宿主细胞的感染能力。

Figure 4. Spectrum of activity of 1,6-epi-cyclophellitol cyclosulfate 11 and iminosugars 1 against SARS-CoV-2.

        基于化合物11在不影响病毒核酸表达的情况下，降低病毒滴度，作者继续研究了化合物11抑制冠状病毒感染的作用机制。首先，作者评价了11是否会直接影响冠状的感染能力，通过斑块检测法量化感染性病毒滴度，发现化合物11对病毒感染性滴度没有影响（Figure 5A）；接下来，作者研究了感染早期进行11处理是否会对病毒核酸复制产生影响，RT-qPCR分析结果显示，细胞内病毒RNA的积累动力学在未处理细胞和化合物11处理细胞中相似，表明化合物对感染早期的RNA复制没有影响（图 5B），这与之前的病毒核酸结果类似；化合物11也可能通过与hACE2相互作用，影响冠状病毒对细胞的感染，为此，作者分别在感染前48或2 h、感染期间（0-1 h）或感染后1 h开始用化合物11处理 H1299/ACE2 细胞单层，并通过斑块缩小试验检测11对病毒感染的抑制能力，发现只有在感染后进行11处理才能阻止斑块的形成（Figure 5C），这说明11并不是通过与hACE2相互作用来降低冠状病毒的感染。

Figure 5. 1,6-epi-Cyclophellitol cyclosulfate 11 inhibits SARS-CoV-2 replication and syncytium formation by reducing intracellular spike protein levels and processing.

        在排除11的可能的抑制机制后，作者怀疑是11对S蛋白的表达产生了影响，从而降低了病毒的感染能力。通过WB分析11处理过的细胞裂解液中S蛋白的表达情况可以发现，细胞裂解液中的全长S蛋白表达量略有减少，而S2亚基条带则几乎完全消失。这表明使用11处理会影响S蛋白在ER中的成熟，从而减少向高尔基体的运输（Figure 5E），免疫荧光染色也获得了类似的结果（Figure 5F）。这些结果均证明，化合物通过抑制ER α-Glu II活性，降低S蛋白的表达与成熟，从而降低了病毒后代的感染性。

        原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acscentsci.4c00506

作者：汪浩

审核：李全才、邵萌

编辑：郭青云

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