文章题目：Production of Alginate Oligosaccharides (AOSs) Using Enhanced Physicochemical Properties of Immobilized Alginate Lyase for Industrial Application

期刊：Marine Drugs

影响因子：5.4

通讯单位：弗林德斯大学医学与公共卫生学院医学与公共卫生学院

        褐藻胶是一类从褐藻中提取的天然多糖，具有丰富的功能特性，如抑菌、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和预防龋齿等。这些特性使其在食品、医药、化妆品和生物材料等多个领域展现出巨大的应用潜力。然而，褐藻胶的高粘度限制了其商业应用，因此在各个工业领域对低粘度、低分子量的褐藻寡糖有很大的需求。与物理和化学水解相比，酶降解是一种更安全、更环保的方法，褐藻胶裂解酶具有较低的能量消耗，并且在使用过程中与有害化学物质的接触相对有限。然而，其高昂的生产成本是限制其广泛应用的主要瓶颈。

        褐藻胶裂解酶(Algate Lyase, AL)是一种通过β-消除机制降解褐藻胶的多糖降解酶。褐藻胶裂解酶可以从海洋环境中自然存在的细菌、藻类和棘皮动物中获得。通过固定化褐藻胶解酶，使其可重复使用，并实现高效水解。

        一些天然的、无机的和合成的高分子材料在之前的研究中被报道用作固定化酶的载体。这些化合物，如纤维素、壳聚糖和琼脂糖，具有理想的支撑性能，如亲水性、物理抗压缩性、抗微生物侵袭性、生物相容性、机械稳定性、大表面积和低成本可用性。然而，当使用大分子底物作为载体时，由于扩散的原因存在局限性。据报道，固定化会对果胶裂解酶等酶的活性产生负面影响，因为底物到达酶的活性位点易受到空间位阻的影响。而纳米颗粒是解决这一问题的理想选择，因为其在水溶液中可表现出显著的布朗运动特性。这种布朗运动能够促进纳米颗粒与周围环境的充分接触，从而增强其分散性，进而为酶活性的发挥提供更为有利的条件。此外，纳米颗粒通过使用外部磁场使结合酶从反应混合物中容易分离。同时，由于固定化导致的蛋白质展开减少也证明了稳定性和酶活性的提高。生物催化效率、比表面积、传质阻力和有效的酶负载是纳米颗粒固定化的理想特性。基于此，研究团队尝试将褐藻胶裂解酶（AL）固定于磁性纳米颗粒（NPs）上，并以戊二醛作为交联剂，成功解决了上述难题。

图形摘要

01、金属离子对固定化酶活性及结合效率的影响

        AL本身为金属酶，活性中心需要特定的金属离子结合才能发挥完整的催化活性。因此作者首先探究了不同金属离子对褐藻胶裂解酶活性的影响，结果如图1A所示。结果表明，Mn²⁺、Zn²⁺、Na⁺和Fe³⁺能显著增强酶活性，使酶活性分别达到未处理样本的89.5%、87.8%、87.7%和85%，且这些金属离子可使褐藻胶的水解率提升超15%（对照组为73.82%）。相比之下，Co³⁺和Cu²⁺对酶活性的提升效果稍弱，分别为77.72%和75.60%，但仍略高于对照组。这表明金属离子对褐藻胶裂解酶的活性有显著的促进作用，其中Mn²⁺、Zn²⁺、Na⁺和Fe³⁺的效果尤为明显。戊二醛用作交联剂。如图1B所示，戊二醛与纳米颗粒的最大结合在孵育1小时内实现。30分钟内达到约50%的相对活性，并且通过加倍时间观察到进一步增加9%，之后延长孵育时间至180分钟并无显著改善。这表明磁性纳米颗粒与戊二醛在60分钟内达到了最佳的活化状态，为后续的酶固定化提供了理想的条件。同时通过改变纳米颗粒与蛋白质的比例（图1C），发现当比例为1:150时，酶的结合效率达到最大值71%。这表明在该比例下，酶与磁性纳米颗粒的结合最为有效。

图1 金属离子对酶活性的影响、纳米颗粒活化情况及酶与纳米颗粒的结合效率

02、表征研究

        利用扫描电子显微镜（SEM）观察到纳米颗粒在固定化前后的形态变化（图2A、B），发现固定化后的纳米颗粒尺寸增大并形成聚集簇，表明酶成功结合到纳米颗粒上。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析（图2C）也证实了纳米颗粒与酶之间的化学结合。

图2 固定化酶的表征

03、固定化酶在不同pH和温度下的酶活性

        固定化后酶的最适反应条件从游离酶的37 ℃、pH 7.4变为45 ℃、pH 9（图3）。这表明固定化过程显著改变了酶的活性条件，使其能够在更高的温度和更碱性的环境下工作。作者推测，这种变化可能是由于固定化过程中酶的微环境发生了改变，从而提高了酶在极端条件下的稳定性。

图3 酶活性的优化

04、固定化酶与游离酶的动力学研究

        通过Lineweaver–Burk作图法，作者计算出游离酶和固定化酶的最大反应速率（Vmax）均为0.2 mg/mL/min，而固定化酶的米氏常数（Km）从游离酶的10.10 mM增加到20 mM（表1）。作者认为，固定化可能导致酶的底物结合亲和力下降，但同时提高了酶的稳定性和可重复使用性，这在工业应用中可能更具优势。

表1 固定化对酶亲和力（Km）和反应速率

05、褐藻胶裂解酶的热稳定性，贮存稳定性与可重复使用性验证

        在酶的热稳定性和储存稳定性方面，作者发现，固定化酶在45 ℃下孵育3小时后仍能保留约50%的活性，而游离酶在相同条件下的活性显著下降（图4A）。此外，固定化酶在4 ℃下储存15天后仍能保持约67%的相对水解能力（图4B）。固定化酶的热稳定性和储存稳定性的显著提升为其在实际应用中带来了显著优势。这种稳定性增强有效降低了因频繁补充酶而产生的成本和操作复杂性，从而提高了酶在工业过程中应用的可行性和经济性。固定化酶在连续使用8次后，虽然活性逐渐下降，但在第8次使用时仍能保留25%的活性（图4C）。同时比较了游离酶和固定化酶对原始大型天然大型藻类的水解效率，发现游离酶在60小时内对天然大型藻类的水解率达到77%，而固定化酶为63%（图4D）。尽管固定化酶的水解效率略低于游离酶，但作者认为其在工业应用中仍具有显著的成本效益和可持续性优势。这是因为固定化酶能够实现多次重复使用，并且在使用过程中可以显著减少酶的流失，从而在长期运行中降低酶的补充成本，提高工艺的整体经济性和环境友好性。

图4 酶的热稳定性和储存稳定性评估

06、高效液相色谱（HPLC）分析

        作者通过HPLC分析了游离酶和固定化酶水解天然大型藻类后释放的单糖和寡糖。结果如表2所示，两种酶的单糖产量相似，但固定化酶释放的单糖量略少于游离酶。此外，固定化酶水解产物中低分子量的寡糖比例较高。作者推测，分子量分布的差异可能对寡糖的生物活性产生影响。具有较低分子量的寡糖可能因其更高的生物利用度而展现出更优异的生物活性。

表2用可溶性酶和固定化酶水解海藻60 h后，海藻中总还原糖的释放

07、抗氧化测定

        最后，作者测定了水解产物的抗氧化能力，发现固定化酶催化的水解产物展现出比游离酶更高的抗氧化能力。作者推测，这可能是由于磁性纳米颗粒中铁分子的存在增强了抗氧化效果，表明固定化酶不仅在酶学性质上有所改善，还可能赋予产物额外的功能性优势。

总结

        该研究成功将褐藻胶裂解酶固定于磁性纳米颗粒，显著提升了其稳定性和可重复使用性。在优化的酶浓度、pH、温度沿着金属离子的影响和动力学研究的条件下，游离酶对海藻酸钠的水解率达到75%以上。固定化酶的结果证实了在较高温度下3 h的活性和热稳定性。此外，固定化增强了酶的稳定性，在升高的pH值从7到9与可重复使用的连续六个循环，其活性的50%。固定化的藻酸盐裂解酶活性可以通过在4 ℃下储存30天以上来保留。在使用游离酶和固定化酶水解海藻生物质时，未观察到游离酶和固定化酶之间的单糖产率的显著变化。然而，显著的变化被观察到在水解模式中，固定化酶与游离酶存在差异。水解产物的主要部分由分子量较高的寡糖组成，其分子量范围为370-470 kDa，占比约60%；而游离酶水解产生的寡糖中，分子量为6 kDa的寡糖占比约为30%。该研究证明了固定化酶的长期可重复使用性和储存性，这表明它是一种具有成本效益和环境可持续性的海藻生物加工方法，以满足工业需求。未来可进一步优化固定化流程，提高酶活性与稳定性，拓展底物范围，并将该技术应用于大规模海藻酸寡糖生产，探索其在多领域的应用潜力。

        原文链接：https://doi.org/10.3390/md22030120

作者：程菁菁

审核：李全才、邵萌

编辑：郭青云

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