文章题目：Using heparan sulfate octadecasaccharide (18-mer) as a multi-target agent to protect against sepsis

发表期刊：PNAS（2023.01）

影响因子：11.1

通讯单位：Division of Chemical Biology and Medicinal
Chemistry, Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina

图1：18-mer治疗脓毒症的作用机制图

        脓毒症（Sepsis）为宿主免疫系统对病原体感染的反应失控，引起的全身炎症反应综合征，从而导致危及生命的器官功能障碍。Sepsis中失调的全身炎症反应很复杂，涉及许多生物学因素和信号通路。损伤相关分子模式，例如胞外组蛋白H3（H3）和高速迁移率蛋白1（HMGB1），被认为是导致脓毒症相关炎症反应大的关键参与者。H3存在于中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil extracellular traps，NETs）中，这些陷阱响应感染而释放H3以执行正常的抗菌功能，但是，H3也可由败血症中的受损细胞释放，作为带正电荷的蛋白质，H3通过与细胞膜中的磷脂-磷酸二酯相互作用直接诱导内皮细胞死亡；除此之外，H3通过toll样受体（TLR）信号通路放大炎症，导致器官损伤。HMGB1是从受损细胞和活化免疫细胞的细胞核释放的另一种阳离子蛋白。研究发现，HMGB1通过递送脂多糖（LPS）导致细胞死亡，从而造成脓毒症小鼠的细胞损伤。

        在这篇文章中，作者合成了三种含有相同二糖组成的的HS低聚糖，分别为六糖（6-mer），十二糖（12-mer）和十八糖（18-mer），并通过研究发现，18-mer通过与H3直接结合或者间接降低LPS/LPS-HMGB1的水平，从而控制炎症反应并提高由盲肠结扎和穿刺（CLP）损伤诱导的多种微生物败血症小鼠的存活率。

        首先，作者通过化学酶法合成了使用3种二糖组成相同的HS来评价HS低聚糖长度与抗炎作用之间的关系。三种HS在非还原端具有GlcNS-GlcA的二糖单元，中间为-IdoA2S-GlcNS-的二糖重复单元，还原端则为的GlcA-pNP（图2A）。具有-IdoA2S-GlcNS-二糖重复单元的三种HS缺乏抗凝活性，并且对肝素酶比较稳定，有利于在有效治疗脓毒症的同时，降低副作用。

图2：18-mer抑制CLP诱导的败血症小鼠的炎症。（A）HS低聚糖及结构；（B）和（C）血浆中H3和HMGB1的浓度；（D-H）血浆中IL-6、MCP-1以及ICAM-1的浓度；（G）和（H）肾脏中肌酐和BUN的表达水平；（I-K）近端肾小管显微照片。

        获得三种HS之后，作者首先在CLP小鼠模型评估了HS的保护作用。结果显示，18-mer能够有效降低血浆中H3和HMGB1的浓度（图2B，C），以及下调炎症因子IL-6，以及MCP-1和iCAM-1的水平（图2D-F）。作者继续评估了18-mer对肾脏损害的保护作用，18-mer给药后发现肌酐和BUN显着降低（图2G，H），并且抑制了CLP模型中的肾脏损伤（图2I-K）。这些结果表明18-mer能够有效降低脓毒症钟不受控制的炎症反应，并降低器官损伤。

        接下来，作者对18-mer针对脓毒症的保护机制进行了研究。首先，评估了18-mer对H3的影响。结果显示，18-mer能够与H3强结合（K_D = 66 nM，图3B），从而降低血液中H3的浓度，减弱H3对EA.hy926的细胞毒性（图3A），并保护致死剂量静脉注射H3的小鼠生命（数据未展示）。

图3：18-mer通过H3和LPS/HMGB1将低模型小鼠的炎症水平。（A）EA. Hy969细胞活力；（B）HS低聚糖与H3的结合能力；（C）和（D）18-mer对内毒素血症小鼠血浆/腹膜灌洗液中IL-6表达水平的影响；（E）和（F）18-mer对LPS/HMGB1复合物的影响。

        接下来作者继续研究了18-mer对HMGB1介导内毒素血症小鼠炎症的影响。结果显示，18-mer能够有效降低LPS注射后腹膜灌洗和血浆中IL-6的浓度（图3C, D），并且阻止了LPS/HMGB1复合物的形成（图3E, F）。作者初步推测18-mer通过与HMGB1的结合，从而破坏LPS/HMGB1复合物，但体外实验结果显示，18-mer并不能直接减少与LPS结合的HMGB1（数据未展示）。作者推测存在间接途径使得18-mer能够有效降低LPS/HMGB1的水平。分析与LPS结合的蛋白发现，注射18-mer使得与LPS结合的ApoA-I增加（图4A，B），进一步研究发现，18-mer可促进ApoA-I与HDL颗粒解离（图4F），释放的ApoA-I不但可以与血浆或者腹膜灌洗液中的LPS结合形成ApoA-I/LPS复合物（图4C, D），促进LPS的清除，而且ApoA-I还可直接破坏LPS/HMGB1复合物（图4B），从而抑制炎症反应。

图4：18-mer 利用 ApoA-I 来减轻炎症并对败血症发挥保护作用。（A）腹膜灌洗液的SDS-PAGE图；（B）腹膜灌洗液的LPS / HMGB1和LPS / ApoA-I水平的免疫印迹图；（C）和（D）血浆和腹膜灌洗液LPS含量；（F）HS低聚糖对HDL/ApoA-I的解离的影响；（G）给药后，CLP小鼠72h存活率。

        最后，作者研究了三种HS对CLP损伤小鼠的保护作用，结果显示18-mer显着提高了存活率，而6-mer对降低致死率没有显着影响（图4G）。

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2209528120

作者：汪浩

审核：李全才

编辑：邵萌

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